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    结合随机诱变及定点基因改造提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量

    作者:admin 发布时间:2021/04/07 浏览量:313



    近日,Journal of Agricultural and Food Chemistry在线发表了江南大学未来食品科学中心和粮食发酵工艺与技术国家工程研究室陈坚院士团队刘松副教授课题组的研究成果“Enhanced production of transglutaminase in Streptomyces mobaraensis through pandom mutagenesis and site-directed genetic modification” (Yin et al., 2021, J. Agric. Food Chem., 2021, 69(10): 3144-3153)。江南大学2017级博士生尹小强为论文第一作者,刘松副教授和陈坚教授为通讯作者,论文作者还包括周景文教授和堵国成教授。


    谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase, TGase, EC 2.3.2.13)能够催化蛋白质(或多肽)之间发生共价交联,被广泛应用于肉制品、乳制品和豆制品等蛋白基食品的质构改良。随着对其催化本质认识的加深,TGase应用迅速拓展至制药、纺织及皮革等非食品领域,并形成独特的应用优势。目前,商品化的TGase主要通过茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)发酵生产。为提高TGase的发酵产量,研究者针对S. mobaraensis诱变选育及基因工程菌构建开展了大量研究。然而,由于缺乏高通量筛选策略,小规模筛选难以获得稳定高产TGase的S. mobaraensis突变株。目前,TGase已经在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、谷氨酸棒杆菌和解酯耶氏酵母中成功表达。由于异源宿主缺乏酶原活化系统,表达后的TGase酶原需进行体外转化或共表达活化蛋白酶才能获活性TGase,产量亦不理想。开发TGase高产菌株仍是科研机构和相关生产企业关注的热点。


    针对上述问题,本研究团队结合随机诱变及定点基因改造提高了茂原链霉菌中谷氨酰胺转氨酶的产量。首先,对S. mobaraensisDSM40587 (smWT)进行ARTP诱变,然后从大约3000(个)×25(轮)突变体中筛选出TGase产量提高5.5倍的突变体(smY2019)。与smWT相比,smY2019中TGase的mRNA水平提高了3.2倍,且发现TGase启动子产生突变。在TGase敲除菌株中回补表达分析表明,突变的TGase启动子比野生型的启动子更强。最后,我们在smY2019基因组中整合了额外的两个TGase表达盒,得到了重组菌株smY2019-3C,TGase的产量进一步提高103%,产量达到40 U/mL。S. mobaraensis是目前唯一被我国《食品添加剂使用标准》(GB2760-2014)和美国食品药品监督管理局认证用于食品级TGase生产的菌株。本研究得到的高菌株将有助于提高食品级TGase工业化生产水平。


    上述研究工作得到了国家重点研发项目(2019YFA0905300;2019YFA0706900)、国家自然科学基金(31771913;32071474)、中央高校基本科研(JUSRP52026A)、国家轻工技术与工程一流学科自主课题(LITE2018-08)等项目的资助。


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    1 ARTP诱变及高通量筛选流程示意图
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    茂原链霉菌ARTP诱变参数优化
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    图3 smWT和smY2019发酵和表型差异分析

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    4 smY2019TGase突变启动子强度验证

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    5 smY2019基因组attB位点整合不同数TGase表达框对TGase表达的影响


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